NMR

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 줄여서 NMR spectroscopy, 간단하게 NMR이라고도 쓴다. 한국말로는 핵자기공명분석법. 유기화합물의 분석에서 탄소와 수소 사이의 framework를 분석해 유기물의 구조, map을 파악하는데 쓰이는 방법이다. IR spectroscopy나 UV spectroscopy와 함께 사용하면 매우 복잡한 유기물의 구조도 알아낼 수 있다. 분석 대상의 전자가 모두 짝이 지어진 경우 diamagnetic NMR, 그렇지 않은 경우 paramagnetic NMR로 분류할 수 있으며, 학부 레벨에서 배우는 대부분의 NMR 테크닉은 diamagnetic NMR 중심으로 되어 있다. 이는 대부분의 분석물들이 diamagnetic이기 때문인데, 금속이 포함된 촉매나 라디칼 등에서 paramagnetic인 것들을 볼 수 있다. Paramagnetic NMR은 보통 시프트 범위와 피크가 넓어서 커플링이 묻히고 해상도가 낮으며 이와 비슷한 테크닉으로는 electron paramagnetic resonance(EPR, ESR)[1]이 있다.

샘플의 종류에 따라서 분류할 수도 있다. 대다수의 샘플은 수소를 모두 중수소로 바꾼 용매에 화합물을 녹인 용액 형태이지만 파트를 갈아끼우면 고체상태로도 분석을 진행할 수 있고 이를 solid NMR이라 부른다.

보통 기기를 300 MHz NMR, 500 MHz NMR 등으로 지칭하는데, 앞의 숫자는 수소의 공명주파수이다. 이것이 높을수록 자기장이 강력하다는것을 의미하며 spectrum의 퀄리티도 좋아지지만 가격도 비싸거니와[2][3], 자석의 덩치도 크고 무거워진다. 그래서 지하, 혹은 지하가 없다면 1층에다가 설치하는 것이 보편적이고 심지어 한 층에 안들어가서 그 윗층까지 차지하는 경우도 있다. 웬만한 유기 화합물들의 분석은 200~600MHz 정도로도 충분하고 그 이상은 단백질 분석 등에 쓰인다.

대형 NMR과는 반대로 휴대가 가능한 소형 NMR도 있다. 위에 서술한 설치식 NMR의 경우 초전도자석을 가동하기 위해 비싼 액체헬륨과 그 헬륨이 떨어지는 속도를 늦추기 위해 액체질소를 주기적으로 공급해줘야 하는 반면, 영구자석과 전자석을 사용하는 300 MHz 이하 대의 NMR은 그런 거 필요 없다. 주변에 NMR 시설이 없을 때 빠르고 간단하게 결과를 얻을 수 있는 것이 장점이다. 자기장이 약하기 때문에 sensitivity는 낮지만 샘플의 농도를 올린다든지, 스캔 수를 늘린다든지 해서 그럭저럭 봐줄만한 ¹H 데이터를 뽑아낼 수 있다. 하지만 ¹H와 달리 ¹³C는 natural abundance가 적어서 헬. 한동안 크고 아름다운 대형, 초대형 NMR이 계속 개발되면서 잊혀지는가 싶더니 간편함과 저렴한 비용을 무기로 다시 주목받고 있다.

대표적인 NMR 관련 제조 회사로는 Bruker와 Varian이 있었으나 Varian은 2010년 애질런트 테크놀로지에 인수된 후 2014년 증발했다. 하지만 쉽게 바꿀 수 없는 기기이다보니 2016년 기준으로도 아직 많이 쓰이고 있다. 2021년까지 고객 지원이 계속될 예정이고, 이후 3년동안 비슷한 수준의 지원을 할거라지만 부품 재고 여부는 장담할 수 없다.

또다른 업체로 일본의 Jeol이 있다. 일본에서는 국가 산업으로 밀어주기 때문에 자국 내 점유율은 40 퍼센트에 육박하지만, 전세계적으로는 아직 앞의 두 브랜드에 비해 미비한 정도이다.

이 NMR 기술을 의학쪽으로 발전시킨것이 MRI이다.

원리는 탄소나 수소의 것을 포함한 원자핵이 양의 전하를 띄고 있고 스핀을 가지면 일종의 자석같은 역할을 가지게 되는데, 이 때 외부자기장을 걸어주어 이들을 정렬시키면 이 자석들이 외부자기장에 평행하거나 반대로 배치되게 된다.

배치된 원자핵에 적당한 전자기 복사[4]를 가해주면 에너지를 흡수하여 스핀플립이 일어나게 되며 이 때 원자핵이 전자기 복사와 공명한다고 표현한다. 이렇게 전자기파가 가해져서 에너지를 받아 들뜬 상태가 된 원자핵은 다시 바닥상태로 돌아가기 위해 에너지를 발산하게 되는데 이때의 에너지는 전자기파 형태로 방출되며 이렇게 원자핵으로부터 방출 된 전자기파를 detector에서 감지하여 적절한 처리를 거치면 스펙트럼의 형태로 결과가 나타나게 된다. 이 공명주파수는 원자핵이 가지는 성질과 가해지는 외부자기장의 세기에 의해 결정되며 당연히 외부자기장이 강할수록 스핀플립을 일으킬 때 더 많은 에너지가 필요하다. 이 외부자기장은 주로 4.7에서 7.0 테슬라 정도로 가해준다.

이때 탄소나 수소의 원자핵이 흡수하는 공명주파수는 해당 탄소나 수소가 결합되어있는 원자나, 결합된 원자에 결합된 원자에까지 영향을 받는다. 원자핵 주위의 전자가 스핀을 가져 생기는 자기장이 외부 자기장을 가리는 등의 이유 때문이다. 이때문에 분석시 피크가 나타나면 분석한 유기물에 어떤 원자와 결합한 수소가 있는지, 어떤 원자와 결합한 탄소가 있는지 알 수 있다! 이를 응용하면 분석된 유기물이 후보중에 무엇인지, 아니면 아예 맨 처음에 언급한 다른 분석법과 병행해 분자구조 자체를 알아낼 수도 있다.

..이해못했으면 유기화학 교과서를 다시 펴자.

이 영상을 보면 이해하는데 정말로 도움이 될 것이다. 내용을 안다면 이해할 수 있다. 영상 마지막 부분은 꼭 보자. 유튜브 영상(영문)

한 종류의 원자핵만 관찰하는 1차원 NMR의 pulse program에서는 pulse와 aquisition time[5]을 각각 한 번씩만 부여한다. 여기에서 2D NMR 실험에서는 pulse를 가하고 바로 aquisition time을 부여하는 것이 아니라 pulse를 한 번 더 때리고 그 뒤에 aquisition time 을 부여한다. 이렇게 되면 pulse를 가하는 시간이 두 번이 되고, 이렇게 pulse를 쏴주면 다른 원자핵 끼리의 correlation 이 나타나게 된다. 이때의 스펙트럼 형태가 2차원 map 형태로 나타나기 때문에 2D NMR이라고 부른다. 이를 응용해서 pulse를 가하는 시간을 3번으로 늘려주면 time이 3번이 되기 때문에 3D NMR이 되는 식이다. 다차원 NMR에서 pulse의 위치와 길이, pulse 종류, evolution time, mixing time 등을 다양하게 바꿔주면 여러가지 형태의 pulse program이 만들어지고 각각의 실험은 전부 다른 결과를 보여주게 된다.

좀 더 간단하게 설명하면 한번에 한 원소만을 관찰하는 것을 1D NMR이라고 하며, 여러 개를 묶어서 같이 보는 것은 multi-dimensional NMR이라고 부른다. 2D의 경우 ¹H와 ¹H 혹은 ¹H와 ¹³C를 주로 보고, 3D는 여기에 ¹⁵N을 추가한다. 자주 쓰이는 2D NMR은 다음과 같다. 수소와 탄소를 예로 들었지만 다른 원소를 쓸 수도 있다.

x-axis에만 chemical shift가 표시되는 1D와는 달리, y-axis에도 chemical shift가 표시된다. 보통 x-axis(f2)에 수소, y-axis(f1)에 탄소가 들어간다. 피크는 동그란 점으로 표시되는데 이게 크고 진할수록 더 intense하다는 얘기다. 쉽게 생각해서, 피크가 듬성듬성 산봉우리처럼 솟아 있고 우리는 그걸 위에서 아래로 내려다보는 것이라고 보면 된다. 1D 스펙트럼에서 intensity를 높이면 피크가 위아래로 늘어나지만 2D 스펙트럼에서는 바닥을 향해 한 층씩 내려가는 개념이다 보니 동그라미가 점점 더 커지는 것이다.

¹H-¹H이나 ¹H-¹³C 등 만을 소개했지만 ¹³C-¹³C간의 correlation을 보는 실험도 있다.
INADEQUATE (Incredible natural-abundance double-quantum transfer experiment) 실험이 그것이다.
이 실험의 결과는 탄소간의 결합을 있는 그대로 보여주기 때문에 이 결과만 가지고도 chemical의 탄소 골격을 직접적으로 알 수 있다.
하지만, 매우 부적절한 실험임을 pulse program의 이름에서부터 알 수 있는데[7] 1%만 존재하는 ¹³C 간의 correlation을 보는 것이기 때문에
탄소 간의 correlation이 나타날 확률은 약 0.01% 이다. (...)

3D NMR은 주로 단백질 분석에 쓰인다. 단백질은 생체고분자화합물로 많은 수의 H, N, C로 이루어져있고 NMR 측정시간을 대폭 줄이기 위해 N15, C13의 동위원소를 흔히 이용한다. NMR을 이용해 단백질의 수용액 상에서 3D 구조, 동력학, 다른 바인딩 파트너와의 결합 상태를 확인할 수 있다. 대표적으로 2D 1H,15N HSQC, 3D CBCA(CO)NH, 3D HNCACB 등이 단백질 펩타이드 백본 정보를 얻기 위해 쓰이고 곁가지 정보를 2D 1H,13C HSQC, 3D HBHA(CO)NH, 3D H(CCO)NH, 3D C(CO)NH, 3D H(C)CH-TOCSY 등을 이용해서 얻는다. 굉장히 많은 NMR 공명 시그널을 찾아내고 분석해야하기 떄문에 소프트웨어의 도움을 많이 받게 된다. 데이터 수집이 끝난 후 후처리를 위해 NMRPipe가 많이 사용되고 실제 분석을 위해 NMRFAM-SPARKYhttp://pine.nmrfam.wisc.edu/download_packages.html와 결합된 여러 자동화 플러그인들이 이용된다.

기본적으로는 적당량의 화합물에 NMR 용매를 넣어 용액으로 만들면 된다. 한번 용매 용기에 들어간 피펫은 세척+건조하지 않으면 다시 사용해선 안된다. 용매 가격이 안그래도 비싼데, 오염된 피펫을 재사용하면 그 용매를 사용한 모든 데이터에 이상한 피크가 나오기 때문에 높은 확률로 교수님의 한숨을 들을 수 있다. 샘플 만들기에 자신이 있다면 튜브에 직접 넣어서 만들 수도 있지만 그렇지 않거나 잘 녹을지 확신이 서지 않는다면 별도의 바이알에 용액을 만들고 튜브로 옮기는 방법도 좋다. NMR 튜브도 가격이 천차만별인데 싸구려 튜브는 표면이 거칠거나 튜브가 완벽하게 반듯하지 않은 경우도 있어서 스펙트럼의 질이 좋지 않거니와 probe안에서 깨지고 고장을 유발할 수 있기 때문에 어느 정도 품질이 보장된 튜브를 써야 한다. 흔히 쓰는 5mm튜브를 사용할 경우 샘플 용액의 양은 600µl(0.6ml)정도가 적당하다. 더 적게 쓰면 스펙트럼의 퀄리티 저하를 불러오고 더 많이 쓰면 용매 낭비에다 농도 하락으로 같은 퀄리티의 스펙트럼을 뽑으려면 더 오래 돌려야 하므로 시간을 낭비하게 된다.

주로 쓰는 NMR 용매는 CDCl₃, DMSO-d₆, D₂O, (CD₃)₂CO, toluene-d₈ 등이 있다. 이들은 ¹H NMR에서 시그널이 나타나지 않게 H를 모조리 중수소 D로 바꾼 용매들인데, D로 교체되지 않은 미량의 H로 인해 solvent peak라 불리는 피크가 나타난다. 이들의 시프트도 잘 기록이 되어 있기 때문에 시프트 기준점과 해상도 확인시 쓸모가 있다.[8]

¹H를 볼 것이 아니라면 사실 아무 용매나 써도 상관은 없지만[9] 중수소가 없으면 automatic shimming을 이용하지 못하고 수동으로 쉬밍을 해줘야 해서 매우 귀찮다. NMR용매를 10%정도만 넣어도 자동쉬밍 기능을 이용할 수 있으니 웬만하면 넣는 것을 추천한다.

샘플 양이 적을 경우 Shigemi tube라는 특수한 튜브가 유용하다. Shigemi tube 겉부분의 크기는 일반 NMR 튜브와 동일하나, 튜브 안에 insert가 있어 분석에 필요한 샘플의 양은 훨씬 적게 만든 튜브이다.

만일 분석 대상이 산소나 수분에 취약하다면 위의 방법으로 샘플 제작이 불가능하다. 이 경우 튜브에 샘플을 넣고 플라스틱 뚜껑 대신 입구를 아예 녹여서 막아버리면 된다. 대체로 샘플이 든 튜브에 Schlenk line 등을 이용하여 부분진공을 잡은 후 토치로 입구를 녹이면 되는데, 이를 쉽게 하기 위해 녹이는 부분이 미리 잘록하게 들어간 NMR 튜브도 시판되고 있다. 일반적으로 5mm 튜브를 사용할 수 있으며, 내경이 큰 10mm 튜브는 녹이다가 튜브에 구멍이 나기 때문에 사용하지 않는다.

입구를 막아버리는 것이기 때문에 튜브를 재활용하려면 입구를 다시 뚫어줘야한다. 유리커터나 끌로 흠집을 낸 뒤 힘을 줘서 부러뜨리면 되는데 흠집을 충분히 내지 않거나 너무 힘을 주면 뾰족하게 깨져서 위험할 수 있으니 두꺼운 장갑을 착용하거나 천 등으로 감싸는 것이 필수이다. 당연한 얘기지만, 막혀 있던 튜브를 잘라서 다시 개봉하는 것이기 때문에 한번 자를 때마다 튜브의 길이가 짧아지게 된다. Sealing하는 과정 중에도 길이 loss가 발생하며, 튜브 길이가 spinner 위로 나오지도 못할 정도로 짧아지면 더 이상 사용이 불가능하여 튜브의 수명이 다하게 된다.

Solid state NMR의 경우 튜브 대신 로터라는 작은 용기를 이용한다. 로터의 크기에 따라 들어가는 샘플의 양이 다르며, 일반적인 고체 샘플의 경우 pestle and mortar로 갈아준 후 로터에 채워서 사용한다. 건조한 고체 외에도 물렁한 반고체 등 샘플의 성상에 따라 인서트를 추가로 사용해야 되는 경우도 있다. 고체 NMR용 로터의 크기는 작지만 값이 꽤 나가기 때문에 깨지지 않도록 조심스럽게 다루어야 한다.

이미지 출처
스피너와 튜브가 끼워진 뎁스게이지.

샘플을 spinner에 끼운 후 depth gauge에 넣어 올바른 지점으로 조절한다. 뎁스게이지를 보면 아랫부분에 구멍이 뚫려있고 길이가 표시되어 있는데, 샘플의 양이 충분하다면 세팅되어있는 정도로 바닥까지 최대한 살짝 밀어넣고 만일 양이 부족하면 중간으로 표시된 부분에 샘플의 중간지점을 맞추면 된다. 주의할점은 이 뎁스게이지 설정보다 샘플을 더 깊게 집어넣으면 절대로 안된다. 마찬가지로, 스피너가 헐렁거린다면 즉시 다른 스피너로 바꿔끼워주자. 깊이를 확인한 후 반드시 뎁스게이지를 빼고 probe에 스피너와 튜브만 넣어야 한다. 별거 아닌 당연한 일 같지만 의외로 이걸 까먹어서 프로브 고장내고 욕먹는사람이 있다고 한다. 간혹 NMR에 샘플을 집어넣었는데 회전이 제대로 되지 않는 경우 스피너의 문제일 가능성이 있다. 회사마다 상이하지만 스피너에 흰색 동그라미 또는 흑백으로 표시가 되어 있는데 이것이 지워지거나 오염이 되어 알아볼 수 없게 되는 경우 회전이 안되거나 불안정하게 되므로, 만일 이러한 문제가 있으면 스피너를 우선 확인해보자.

¹H나 ¹³C 실험은 워낙 사람들이 많이 써서 웬만하면 이미 셋업이 잘 되어 있다. 400MHz 이하의 경우 샘플을 probe에 집어넣고 회전, 용매 설정, z0찾기, 자동 쉬밍, 시작버튼 누르면 끝이고 500MHz이상에서는 투입 후 튜닝 단계가 추가된다. 샘플 회전을 할 수 없는 경우 x1, y1, xz, yz정도를 수동으로 조절해줘야 한다.

2D실험은 일단 ¹H와 HSQC/HMQC/HMBC의 경우 ¹³C 데이터를 먼저 뽑은 다음, 그 세팅을 이용하여 2D데이터를 얻는다.

¹H와 ¹³C 이외의 다른 원소를 관찰하려면 capstick이나 프로브, 필터 등을 적절히 교체해야 하는 경우가 많은데 많이 해보지 않았다면 관리자에게 도움을 요청하자. 괜히 나섰다가 프로브가 망가지기라도 하면 관리자는 물론이고 온 학과 사람들에게 욕이란 욕은 다 먹게 된다.

상온이라면 신경쓰지 않아도 되지만 특정 온도에서 실험하기를 원할 경우 프로브마다 사용 가능한 온도 범위가 정해져 있어서 이를 사전에 반드시 확인해야한다. 상온에서 약 60도까지는 공기를 써도 되지만 상온보다 낮은 온도를 원하거나 60도 이상일 경우 질소로 바꿔줘야한다. 온도를 낮출 때 액체질소나 드라이아이스 배스를 사용하는데 이때 보통 공기처럼 사용하는 가스에 수분이 있다면 얼음이 생겨서 가스통로가 막히기 때문. 가스가 통하지 않으면 샘플을 프로브에서 뺄 수 없는건 둘째치고 온도조절에 지장이 생겨서 프로브 내부 히터가 타버리는 참사가 발생할 수 있기에 꼭 질소를 사용하여야 한다.

기본적으로는 다른 연구원들이 갈아넣어져서 열심히 작성한 표가 있으니 그래프에서 나타나는 피크가 어느 원자결합을 의미하는지 표에서 찾아서 결과를 얻으면 된다.

일반적으로 그래프에서 x축은 chemical shift이며, TMS를 기준으로 삼는다.(TMS는 테트라메틸규소로 규소에 메틸기가 4개 달려있는 심플한 구조이다) 이 TMS의 chemical shift를 0으로 잡으면 대부분의 피크는 TMS보다 아래쪽에 나타난다.

생체고분자 NMR 의 경우는 주로 DSS를 기준으로 삼는다. 많은 탄소 chemical shift 를 기반으로 한 분석은 기준점을 어떻게 잡느냐에 따라 다른 결과를 주니 LACS와 같은 알고리즘을 이용해 오프셋을 조절하도록 하자.

그래프는 피크가 나타나는 형태로 쓸 때도 있지만, 이를 적분한 그래프를 쓰기도 한다.

수소원자의 NMR에서는 결과가 단순 피크로 나타나는게 아니라, 여러 개의 피크가 붙어있는 형태로 나오기도 한다. 이를 multiplet이라고 한다. 이 현상은 이웃한 원자와의 상호작용과 커플링 때문에 발생한다.

이때, 화학적으로 완전히 동등한 원자들은 이 분할을 만들지 못하고, n개의 동등한 이웃한 원자핵들이 n+1개의 피크를 만든다. 무슨소리냐면 현재 피크어 해당하는 H, 이 H에 연결된 C가 있고, 다시 이 C에 연결된 C에 서로 동등한 H가 n개 달려있으면 n+1개의 피크가 생성된다. 이 쪼개짐 또한 분석에 있어 중요한 정보이다.

어떤 C에 붙어 있는 H냐에 따라서 chemical shift 영역이 다르기 때문에 chemical shift를 따져보면 어떠한 구조가 있을지 유추해볼 수 있다. 이를테면 1 ppm 언저리는 methyl group, 7 ~ 8 ppm 근처는 aromatic H 등. 또한 일반적으로 1H NMR에서는 피크 적분값을 이용하여 H 갯수를 구할 수 있고, 정량에도 써먹을 수 있다.

모든 탄소원자에서 NMR이 가능한 것은 아니다. 일반적인 원자량 12짜리, 중성자 6개짜리 탄소는 NMR 분석이 불가능하며, 원자량 13짜리 탄소만 NMR이 가능하다. 이 방법을 이용해 동등하지 않은 탄소의 수를 셀 수 있다.

1H와 마찬가지로 chemical shift를 통해 functional group을 대충 유추해볼 수 있다. 보통 100 ~ 150 ppm은 aromatic C, 그 이상은 carbonyl group 등. Proton과 달리 일반적인 조건에서 Carbon NMR은 정량에 거의 사용되지 않는다.

골때리는 축약어가 유난히 많다. COSY, NOESY, DANTE, INADEQUATE, PANSY 정도는 애교, HEHAHA혹은 HOHAHA같은 엉뚱한 약어도 많으며 Proton-enhanced Nuclear Induction Spectroscopy[10] 같은 것도 있다. 이쯤 되면 과학자들이 일부러 이러는 것이 확실하다.